1929年7月，张学良以武力从苏联人手中接管中东铁路，这便是著名的中东路事件，这一事件引发的连锁反应直接促使陈独秀被开除出党。
　　
　　　　中东铁路是沙俄为侵略中国、控制远东而在中国领土上修建的一条铁路。十月革命后，苏俄再三声明归还中东路主权，但仅仅停留在口头上。中东路事件发生后，共产国际立即作出强烈反应，指示各国共产党要发动一个“保卫苏联”的运动，中共中央积极响应，频频发出宣言、决议和文章。陈独秀按捺不住，再次提笔，于7月28日致信中央常委，批评中央在中东路问题上的宣传，“太说教式了，太超群众了，也太单调了”，他还提出了新的口号：“反对国民党政府对于中东路的卖国政策或‘误国政策’”，用以代替“武装保卫苏联”，因为这个口号“反而使群众误会我们……不顾及民族利益”。一个星期之后，陈独秀又致信中共中央，批评当时的左倾盲动路线。
　　
　　　　中央严厉地斥责了他的信，于8月28日派人与陈独秀谈话，批评他不应该发表和中央不同的意见。共产国际代表甚至以开除党籍予以警告，希望他与中央保持一致。陈独秀依然我行我素，表示：“我不应再为寻常组织纪律所拘囚，更不必阻止同志们传观我的信稿。”在此期间，陈独秀读到苏联反对派领袖托洛茨基的著作，发现托洛茨基早在大革命失败前就公开指出共产国际对中国革命基本路线的指挥错误，在革命失败后又指出斯大林应当担负的责任。陈独秀如遇知己。1929年9月，他和彭述之、尹宽等人成立中国共产党左派反对派，即中国托派。当时，共产国际正在国际范围内掀起反托派斗争，根据共产国际的指示，中共中央政治局于11月15日作出决议，开除陈独秀的党籍。12月10日，陈独秀发表了《告全党同志书》，对中共中央开除自己的理由逐条辩解，认为大革命失败的根源在于共产国际的错误支配，而自己因“认识不彻底，主张不坚决，动摇不定”，“深深地沉溺在机会主义的大气中，忠实地执行了国际机会主义的政策”。 陈独秀的《告全党同志书》未能在党内公开，但蒋介石通过侦讯部门看到了。他认为陈是一个“真共产党员”，是最可怕的敌人，于是悬赏三万大洋，仍以“共党要犯”重点追捕。