蔡元培在北大的推行的教育改革，一直受到北洋安福系政客的攻击。他发表致林纾的公开信后四十七天，北京爆发了五四运动。
　　
　　 1919年春，中国以战胜国的地位出席巴黎和会，却未能废除列强在华特权及袁世凯与日本签订的《二十一条》密约。外交失败的消息传到北京，林长民5月2日在《晨报》发表《外交警报敬告国民》，披露了这一消息。同日，蔡元培也将北京政府密令签约的内幕告知北大学生罗家伦、傅斯年，并召集全校教职员开会商讨挽救之策。
　　
　　 5月4日北大学生结队出发请愿时，蔡元培有过劝阻之举，但很快就放弃了。他一向主张“读书不忘救国”，同时也认为：“学生在学校里面，应以求学为最大目的，不应有何等政治的组织。其有年在二十岁以上，对于政治有特殊兴趣者，可以个人资格参加政治团体，不必牵涉学校”。过去他也曾两次劝阻过学生游行，但这一次态度不同，他在电话中对教育总长傅增湘说：“学生爱国运动，我不忍阻止。”
　　
　　 游行学生焚烧曹汝霖住宅、痛殴章宗祥的事件发生后，蔡元培全力营救被捕学生，尽到了校长的天职。他向学生们保证：“你们放心，被捕同学的安全，是我的事，一切由我负责。” 5月5日，教育部下令要求各校校长将为首滋事学生一律开除。蔡元培等十四所大专院校校长在北大开会，认为“若指此次运动为学校运动，亦当由各校校长负责”，蔡元培表示“愿以一人抵罪”，当场议决成立校长团，向当局请愿营救。5月7日，北京政府迫于全国舆论压力，释放了被捕学生。
　　
　　 当局认为蔡元培是学潮的幕后指使人，内阁会议上提出了解散北京大学，撤换蔡元培等主张，教育总长傅增湘也遭众人围攻。被捕学生安全返校后，蔡元培为承担责任，于8日提出辞呈。同日，北京政府内定由马其昶取代蔡元培，并下令将已释放的学生送交法庭，整饬学风。在这种情势下，蔡元培于5月9日挂冠出京，经天津南下转抵杭州。
　　
　　 北大师生一再向教育部请愿，要求挽留蔡校长，其他院校师生也一齐声援。北京各大专院校校长同上辞呈，表示与蔡共去留。5月19日，北京学生总罢课。6月15日，蔡元培发表《不肯再任北大校长的宣言》，提出：一、我绝对不能再作那政府任命的校长；二、我绝对不能再作不自由的大学校长；三、我绝对不能再到北京的学校任校长。
　　
　　 他强调：“思想自由，是世界大学的通例。得意志帝政时代，是世界著名开明专制的国度，他的大学何等自由。那美、法等国，更不必说了”；“北京大学，向来受旧思想的拘束，是很不自由的”；自己到任后稍稍有所革新，就被守旧势力视为“洪水猛兽”，“又不能用正当的辩论法来辩论，鬼鬼祟祟，想借着强权来干涉”；“世界有这种不自由的大学吗？还要我去充这种大学的校长吗?”
　　
　　 蔡元培这三个“不”，真是掷地有声。有学者总结说，他提出了中国现代大学的三项基本原则：第一，大学应当是独立的和自主的；第二，大学应当具有思想自由和学术自由；第三，大学学术与思想自由需要相应的自由的社会政治环境。
　　
　　 五四运动的影响播及全国，引发了全国学生的罢课，工商各界同仇敌忾，以罢工罢市作为声援。北京政府迫于压力，下令慰留蔡元培，罢免曹汝霖、章宗祥、陆宗舆。北大师生代表到杭州恳请，蔡元培才应允回校。回校以前，他发表《告北大学生暨全国学生书》，提出学生救国，重在专研学术，不可常为救国运动而牺牲。同年9月20日，蔡元培重新回到北大视事。
　　
　　 蔡元培从1917年出任北京大学校长，到1927年离任，掌校十年有半。其间因各种政治原因，曾七次提出辞职，毫无恋栈，足见他从来就不是一个教育官僚。此后，他长期担任中央研究院院长，直至逝世。